實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-QPCR）技術(shù)是一種高靈敏度的分子生物學(xué)檢測方法，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域。本文將詳細(xì)介紹使用 Q2000B 熒光定量 PCR 儀進(jìn)行 RT-QPCR 實(shí)驗(yàn)的操作流程，幫助讀者更好地理解和應(yīng)用這一技術(shù)。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)前，需要準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和耗材。試劑包括特異性 PCR 引物、新鮮提取的總 RNA 以及相關(guān)的試劑盒。此外，還需要確認(rèn)所需的儀器和耗材，如實(shí)時(shí)定量 PCR 儀、多孔板等。
二、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1. 配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：包括模板、引物、dNTP 混合物等。
2. 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：使用總 RNA 合成 cDNA 第一鏈。
三、Q-PCR 擴(kuò)增
1. 配置 PCR 反應(yīng)體系：包括 cDNA 產(chǎn)物、Master Mix、引物等。
2. 設(shè)置 PCR 程序，包括預(yù)變性、擴(kuò)增循環(huán)、延伸等步驟。
3. 運(yùn)行 PCR 實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)監(jiān)測樣品擴(kuò)增情況。
四、數(shù)據(jù)分析
1. 樣品編輯：設(shè)置陰性對照、空白對照、標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品等。
2. 結(jié)果分析：查看擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、Cp 值等數(shù)據(jù)。
五、Q2000B 熒光定量 PCR 儀的特點(diǎn)
1.角度調(diào)節(jié)屏幕：儀器屏幕角度可 90° 調(diào)節(jié)，適合不同視角使用。
2. 同步熒光檢測：相同通道的熒光檢測同步，延時(shí)誤差減少。
3. 全真彩觸控屏：自帶 10 英寸全真彩觸控屏，可以在屏幕上編輯、查看、運(yùn)行的定量 PCR 和普通 PCR 程序，無需連接電腦。
4. 新一代半導(dǎo)體升降溫技術(shù)：采用進(jìn)口半導(dǎo)體芯片，變溫速率可達(dá) 6 °C/SEC，使用壽命達(dá) 100 萬次循環(huán)。
5. 頂部檢測技術(shù)：采用頂部檢測技術(shù)，屏蔽背景干擾，提高熒光信號(hào)靈敏度和信噪比，可使用白管和透明管，獲得準(zhǔn)確結(jié)果。
6. 溫度梯度功能：具有溫度梯度功能，優(yōu)化反應(yīng)條件，并配有遠(yuǎn)程操控，實(shí)時(shí)查看實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析結(jié)果。
7. SSLPTM 短光程靜態(tài)熒光 CCD 成像技術(shù)：采用 SSLPTM 短光程靜態(tài)熒光 CCD 成像技術(shù)，熒光信號(hào)穩(wěn)定、靈敏。
六、熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)操作流程
1. 打開 Q2000B 熒光定量 PCR 儀，確認(rèn)儀器設(shè)置正確。
2. 在全真彩觸控屏上編輯 RT-QPCR 實(shí)驗(yàn)程序，包括預(yù)變性、擴(kuò)增循環(huán)、延伸等步驟。
3. 配置 PCR 反應(yīng)體系，加入 cDNA 產(chǎn)物、Master Mix、引物等。
4. 將反應(yīng)體系分裝至多孔板中，設(shè)置陰性對照、空白對照、標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品等。
5. 將多孔板放入 Q2000B 熒光定量 PCR 儀中，啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)程序。
6. 實(shí)時(shí)監(jiān)測樣品擴(kuò)增情況，觀察擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、Cp 值等數(shù)據(jù)。
7. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中目的基因的濃度。
七、注意事項(xiàng)
1. 確保所有 RNA 相關(guān)的操作均佩戴手套，防止 RNase 污染。
2. 嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，避免使用渦旋振蕩。
3. 確保 PCR 儀器的正確設(shè)置，以獲得準(zhǔn)確的擴(kuò)增結(jié)果。
4. 試劑需在規(guī)定條件下儲(chǔ)存和使用，如 SYBR Green I Master 需避光放置。
5. 注意數(shù)據(jù)分析方法的選擇，如標(biāo)準(zhǔn)曲線法、絕對定量法等。
Q2000B 熒光定量 PCR 儀 能夠提供高靈敏度和高準(zhǔn)確度的 RT-QPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過合理選擇實(shí)驗(yàn)方法、嚴(yán)謹(jǐn)操作和準(zhǔn)確分析，可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。掌握該技術(shù)的基本原理和操作要點(diǎn)，對于提高科研水平和醫(yī)學(xué)研究能力具有重要意義。更多實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備請進(jìn)入蘇州阿爾法生物網(wǎng)站進(jìn)行了解。
