膜的選擇，印跡所使用的膜的類型可能影響下列因素：
NC膜和PVDF膜是Western blotting中常用的兩種膜。NC膜是世界上使用最為廣泛的特異性轉(zhuǎn)移介質(zhì)之一，也是最早用于Western blotting的膜。PVDF膜在1985年被開(kāi)發(fā)出來(lái)，在嚴(yán)苛條件下表現(xiàn)出更高的蛋白保留，比如有機(jī)溶劑存在時(shí)，或者在酸性或堿性條件下。
NC膜與蛋白質(zhì)之間靠靜電和疏水作用結(jié)合，NC膜是親水膜，無(wú)需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響小；背景低；價(jià)格低廉，使用方便。缺點(diǎn)是韌性較差，易損壞，不能反復(fù)使用。在非離子型去污劑作用下，結(jié)合的蛋白容易被洗脫下來(lái)。
PVDF膜與蛋白質(zhì)之間靠疏水作用結(jié)合，與NC膜相比，PVDF膜有著更高的機(jī)械強(qiáng)度和出色的化學(xué)穩(wěn)定性，適合多次剝離（stripping）和反復(fù)檢測(cè)（reprobing）。同時(shí)，PVDF膜有著更高的結(jié)合能力，NC膜的典型結(jié)合能力是80 -100 μg/cm2，而PVDF膜達(dá)到150-160 μg/cm2 （結(jié)合強(qiáng)度 PVDF膜比NC膜強(qiáng) 6 倍），這意味著靈敏度更高。由于PVDF膜的疏水性，成為疏水蛋白質(zhì)（如膜蛋白）的機(jī)構(gòu)疏松。也正因?yàn)槿绱耍琍VDF膜需要甲醇潤(rùn)濕才能被常規(guī)的轉(zhuǎn)膜液所浸潤(rùn)，繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)膜與蛋白結(jié)合。
綜上，現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室印跡轉(zhuǎn)印膜常用PVDF膜而非NC膜。
在分子水平，蛋白質(zhì)吸附至少部分源于疏水氨基酸側(cè)鏈與聚合物表面疏水區(qū)的相互作用。Matsudaira（1987）觀察到，在疏水殘基被切割之后，小肽的測(cè)序效率下降80%，這可能是由于殘余肽段被洗脫。同時(shí)，在肽段消化降解時(shí)，也觀察到疏水肽段往往不能像親水肽段那樣高效洗脫（Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和Lyman（1991）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)印緩沖液中添加的Ca2+離子可增強(qiáng)鈣調(diào)蛋白與Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜的結(jié)合。鈣的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)疏水袋，從而增加蛋白與膜的結(jié)合。
綜上，PVDF膜結(jié)合蛋白的機(jī)理：PVDF膜的表面具有疏水性，而許多蛋白質(zhì)也具有疏水性區(qū)域，PVDF膜表面和蛋白質(zhì)疏水區(qū)域之間發(fā)生疏水作用導(dǎo)致其相互結(jié)合。
PVDF膜為什么需預(yù)先活化：
PVDF膜本質(zhì)是一種疏水性的聚合物，具有疏水性且不帶電荷，不能被轉(zhuǎn)膜液所浸潤(rùn)，為了在水性緩沖液中使用，需要在使用前進(jìn)行預(yù)處理以浸潤(rùn)和活化膜。最常見(jiàn)的方法是使用50%（v/v）或更高濃度的醇（甲醇、乙醇和異丙醇）溶液浸潤(rùn)和活化，使PVDF膜中微孔內(nèi)的空氣被低表面張力的甲醇所替代，從而易于后續(xù)水或者緩沖液進(jìn)入PVDF膜中的微孔內(nèi)，使PVDF膜從疏水性變成親水性，隨著膜的外觀從不透明變?yōu)榘胪该?，表明PVDF膜已經(jīng)浸濕。之后用水反復(fù)沖洗以去除醇類，再將膜直接放入轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡。一旦膜被浸濕，通過(guò)電轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)與膜接觸產(chǎn)生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。
在電轉(zhuǎn)移過(guò)程中，蛋白與膜的結(jié)合貫穿整個(gè)膜的厚度(深度)，結(jié)合能力是由孔的內(nèi)部表面積來(lái)決定的（Mansfield，1994）。隨著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固，但是膜孔徑如果小于0.1 μm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了，原因是蛋白質(zhì)分子的直徑大約在1-100納米之間。
PVDF膜孔徑越小對(duì)低分子蛋白吸附越牢固的機(jī)理：較小的孔徑會(huì)限制蛋白分子的運(yùn)動(dòng)，使其轉(zhuǎn)移速度變慢，蛋白與膜的結(jié)合更充分，更容易被攔截在孔道內(nèi)。此外，較小的孔徑也可以提供更高的膜表面積，從而提高了蛋白與膜接觸的機(jī)會(huì)。同時(shí)，較小的孔徑也可以提供更高的表面密度，從而增加了孔道與溶液之間的分子間吸引力，這種吸附方式稱為“毛細(xì)作用"。Schweitzer和Kriz在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，較小的孔徑可以提供更高的蛋白密度并增強(qiáng)其吸附能力。另一方面，蛋白分子量越低，蛋白的比表面積越大，與膜接觸面越大越充分，結(jié)合更緊密。
通常情況下，大于20 kD的蛋白選擇0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白選擇0.2 μm的膜。0.2 μm PVDF膜內(nèi)部表面積大約是0.45 μm PVDF 膜的三倍，使其吸附能力更高。總之，選擇PVDF膜的孔徑大小需要根據(jù)樣品蛋白的大小和特性來(lái)確定，以獲得較好的結(jié)合效果。
